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聚合酶鏈式反應( PCR)技術循環檢測方法
點擊次數:75 更新時間:2025-07-15

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術。其核心原理是模擬生物體內的DNA復制過程,通過特定的引物、DNA聚合酶和dNTPs(脫氧核糖核苷酸)來實現目標DNA序列的指數級擴增。

PCR技術的實現依賴于三個關鍵步驟的循環進行:

一、變性(Denaturation):在高溫(通常90-96℃)下,雙鏈DNA模板中的氫鍵斷裂,導致雙鏈分開為兩條單鏈。這是擴增過程中的第一步,也是將模板DNA變成單鏈狀態的過程。

二、退火(Annealing):溫度降低(通常50-65℃)后,引物與單鏈DNA模板上互補的序列結合。引物是短的DNA序列,設計用于與目標DNA片段的兩端特定區域互補,從而引導后續的合成過程

三、延伸(Extension):在中溫(通常72℃左右)下,Taq DNA聚合酶(一種耐熱DNA聚合酶)作用于引物-模板復合物,沿著模板DNA合成新的互補鏈。這個過程中,dNTPs被聚合到引物的3'端,形成新的DNA鏈,直至達到模板的末端。

這三個步驟組成一個循環,每完成一個循環,目標DNA片段的數量理論上增加一倍。通過25-35個循環,可以將目標DNA序列擴增至數百萬倍,從而達到可以檢測的水平。

 

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PCR技術的檢測方法主要依賴于擴增產物的檢測,傳統的PCR通常通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測產物。隨著技術的發展,出現了實時熒光定量PCR(qPCR)和數字PCR(Digital PCR, dPCR)等更為先進的檢測方法。

一、傳統PCR檢測:

瓊脂糖凝膠電泳:擴增后的DNA片段通過電泳分離,根據其大小在凝膠上形成條帶,通過觀察條帶的出現與否來判斷擴增是否成功。

二、實時熒光定量PCR(qPCR):

熒光染料法:使用SYBR Green I等染料,其能嵌入雙鏈DNA中并在熒光下發光,隨著PCR循環的進行,熒光信號逐漸增強,通過檢測熒光強度來定量目標DNA。

探針法:采用TaqMan探針等熒光標記探針,探針與目標序列結合后被DNA聚合酶酶切,報告基團與淬滅基團分離,釋放熒光信號,通過實時監測熒光信號的變化來定量目標DNA。

三、數字PCR(dPCR):

油包水液滴式數字PCR(ddPCR):將樣本分成數萬個獨立的微滴(液滴),每個微滴中包含少量的DNA模板。通過PCR擴增后,檢測每個微滴中的熒光信號,陽性信號表示微滴中含有目標DNA,陰性信號則表示沒有。通過泊松分布計算,最終獲得目標DNA的絕對定量結果。

數字PCR技術由于其不依賴標準曲線、操作簡單、靈敏度高(±10% copies/μL)和適合低豐度目標檢測等優勢,已成為一種非常有潛力的核酸定量技術。與傳統qPCR相比,它在低拷貝數目標檢測、拷貝數變異分析、稀有突變檢測等領域展現出有的優勢。